style="width:1.12666in;height:0.619in" /> 本文是学习GB-T 34796-2017 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了使用紫外分光光度法检测水溶液中核酸的浓度和纯度的原理、样品制备及检测方法。
本标准适用于水溶液中核酸的浓度和纯度检测，可对浓度在5
ng/μL及以上的水溶液核酸样品定
量检测和纯度分析。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 11165 实验室 pH 计
GB/T 26813 双光束紫外可见分光光度计
JJG 646 移液器检定规程
下列缩略语适用于本文件。
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
RNA: 核糖核酸(ribonucleic acid)
核酸中嘌呤和嘧啶碱基有共轭双键，具有吸收紫外光的性质，其最大吸收值在波长为250
nm ~ 270nm
之间。碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，最大吸收波长约260
nm, 吸收 低峰在230 nm。 在波长260 nm 处，1单位 OD 值的光密度相当于双链
DNA 浓度为50 μg/mL、 单链 DNA 及 RNA 为40μg/mL、 单链寡核苷酸为33μg/mL,
利用此量和浓度关系，可用于计算核酸样品
的浓度。
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
小牛胸腺 DNA 标准溶液。
5.2 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(1 mol/L Tris-HCl,pH
7.4)
称取121.1 g Tris置于1 L 烧杯中，加入800 mL 去离子水，充分搅拌溶解，用
NaOH 调节 pH 值，
GB/T 34796—2017
定容至1 L, 分装后在103 kPa(1.05 kg/cm²)高压蒸汽灭菌20
min,室温保存，备用。
5.3 EDTA(500 mmol/L,pH 8.0)
称取186.1 g Na₂EDTA ·2H₂O,置 于 1 L 烧杯中，加入约800 mL
的去离子水，充分搅拌，用
NaOH 调节 pH 至8 . 0 (pH 至 8 . 0 时 ，EDTA 才能完全溶解),定容至1 L,
分装后在103 kPa
(1.05 kg/cm²)高压蒸汽灭菌20 min,室温保存，备用。
5.4 TE 缓冲液(10×TE Buffer,pH 7.4)
量取100 mL1 mol/L Tris-HCl(pH 7.4),20 mL 500 mmol/L EDTA(pH 8.0)置于1 L
烧杯中， 加入800 mL 去离子水，混合均匀，定容至1L, 分装后在103 kPa(1.05
kg/cm²)高压蒸汽灭菌20 min,
室温保存，备用。
6.1 紫外分光光度计或核酸蛋白测定仪，应符合GB/T 26813 的要求。
6.3 电子天平：精度分别为0.1 mg、0.01 mg。
6.4 pH 计，0.1级，应符合 GB/T11165 的要求。
6.5 可调移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL,应符合JJG 646
的要求。
将适量核酸样品溶解于无菌水或 TE 溶液中，稀释至工作曲线范围内供测定。
检测波长：260 nm。
检测波长：260 nm、230 nm、280 nm。
取适量核酸溶液(溶液体积根据仪器要求)检测，以稀释溶液调零，根据波长260
nm、230 nm、
280 nm处核酸的吸光度，计算 DNA 双链、DNA 单链和 RNA 的浓度，根据 OD /OD
和 OD6/
OD230 比值判断核酸纯度。重复测定3次取平均值。核苷三磷酸的特性参见表 A.1
及纯化的 DNA 的 分光光度测定结果参见表 B.1。
核酸浓度按照以下公式计算：
GB/T 34796—2017
a)
核酸样品摩尔浓度含量按式(1)计算：
式中：
c— 样品浓度，单位为摩尔每升(mol/L);
A—- 吸光度；
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……………………
(1)
E 波长依赖的摩尔消光系数，单位为升每摩尔厘米[L/(mol ·cm)];
b—— 光程，单位为厘米(cm)。
b) 样品的质量浓度按式(2)计算：
p=OD²60×B …………………… (2)
式中：
p —— 样品浓度，单位为克每升(g/L);
OD₂o— 光程为1 cm 时在260nm 波长下的吸光度值，单位为每厘米(cm⁻¹);
B —— 平均消光系数[(μg/mL)¹ ·cm⁻¹]。
注：对于大分子核酸来说，其浓度计算时可采用平均消光系数。对于较小的寡核苷酸，可根据式(3)由碱基组成精
确计算出摩尔消光系数，再根据式(2)计算寡核苷酸浓度。
E=A(15.3)+G(11.9)+C(7.4)+T(9.3)
式中：
E — 毫摩尔消光系数(寡核苷酸的浓度 一 般以 mmol/L 表 示 ) ;
A 、G 、C 、T——寡核苷酸序列中每个核苷酸的个数。
样品纯度根据式(4)、式(5)计算，按照表1进行判断：
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style="width:1.24671in;height:0.63998in" />
…………………… (3)
(4)
(5)
表 1 吸光度法检测核酸纯度结果判断表
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检测波长：220 nm～340nm 范围内全波长扫描，并设置报告260 nm 值、280 nm
值、OD₂6o/OD₂80、
OD0/OD2 比值。
GB/T 34796—2017
取适量稀释溶液(溶液体积量根据仪器要求而定),在220 nm～340 nm
范围内扫描，调仪器基线
(调零)。
取适量核酸溶液或标准溶液(溶液体积量根据仪器要求)检测，显示吸收光谱图，读取260
nm 值、
280 nm 值、OD26/OD₂ s、OD26/OD
比值，重复测定3次取平均值。较纯的核酸紫外吸收光谱扫描图
参见图 C.1。
仪器自动读取。
按9.2.2中OD/OD2o、OD2o/OD23 及结合表1判断纯度。
GB/T 34796—2017
(资料性附录)
核苷三磷酸的特性
核苷三磷酸的特性见表A.1。
表 A.1 核苷三磷酸的特性
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GB/T 34796—2017
(资料性附录)
纯化的 DNA 的分光光度测定结果
纯化的DNA 的分光光度测定结果见表 B.1。
表 B.1 纯化的 DNA 的分光光度测定结果
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style="width:3.09333in" />GB/T 34796—2017
(资料性附录)
核酸紫外吸收光谱扫描图
核酸紫外吸收光谱扫描图见图C.1。
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波长/nm
图 C.1 核酸紫外吸收光谱扫描图
更多内容 可以 GB-T 34796-2017 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法. 进一步学习